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【解讀】周斌組揭示胚胎期衰老細胞的命運

作者:Estelle 日期:2018-06-12 標籤: 分類:閱讀:54

6月5日,國際學術期刊Cell Research在線發表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所周斌組的最新研究進展「Embryonic senescent cells re-enter cell cycle and contribute to tissues after birth」。此研究揭示了小鼠胚胎髮育過程中衰老細胞(senescent cell)的命運,衰老細胞不會被全部清除,其中一部分可以保留到出生後,並且部分細胞會重新進入細胞周期,進行增殖。該研究拓寬了人們對細胞衰老的認識,暗示了胚胎髮育過程中,細胞衰老可能是一個暫時的細胞狀態,並且具有可逆性。


P21-CreER 和 P21-tdTomato 基因敲入小鼠模型由南模生物構建。


 

細胞衰老是指隨着時間的推移或面臨外界應激壓力時,細胞增殖能力減弱,脫離細胞周期,該過程與機體衰老(aging),多種疾病(如腫瘤,動脈粥樣硬化等)以及組織的損傷後修復等過程具有重要的聯繫。近期研究發現,小鼠正常胚胎髮育過程中中腎管、內耳淋巴囊、神經管和四肢頂外胚層嵴等處有細胞衰老的出現,並且揭示了胚胎髮育過程中細胞衰老對組織器官的結構形成起到一定作用。而且研究中指出,在胚胎髮育後期,衰老的細胞都會被清除。然而這些研究都是基於P21的表達和SAβ-Gal的染色,並不能說明衰老細胞的真實命運。

 

P21是胚胎衰老的分子標誌,並且在頂外胚層嵴處(AER)的SAβ-Gal+衰老細胞中高表達。研究人員首先通過P21和SAβ-Gal的染色確認它們在四肢頂外胚層嵴處(AER)從E15.5天開始消失。


通過將2A-CreER共表達元件敲入到小鼠P21基因終止密碼子前,構建了P21-CreER工具小鼠,與R26-LSL-tdTomato小鼠交配,可由他莫昔芬誘導譜系示蹤。結果發現被tdTomato標記的細胞在E11.5和E12.5天不會增殖,而且會表達衰老細胞的marker,P21、CD44和HP1γ。另外,通過FACS分選E12.5天被標記的細胞,發現這些細胞都會呈現SAβ-Gal的活性。證明了工具小鼠可以在體內標記胚胎時期的衰老細胞,並且可運用P21-CreER小鼠研究衰老細胞的命運。


利用P21-CreER;R26-tdTomato小鼠對胚胎時期的衰老細胞進行譜系示蹤研究,發現四肢頂外胚層嵴處的衰老細胞在E15.5和E16.5天並不會完全被清除,而是一直能存活到出生後,只是不再表達P21,也沒有了SAβ-Gal的活性。通過EdU和Ki67染色發現,示蹤的衰老細胞在胚胎髮育後期會進入細胞周期,重新增殖。其他衰老的組織器官處的衰老細胞也存在同樣的現象。這一發現首次在體內揭示了衰老細胞的命運,並且暗示了胚胎髮育過程中,細胞衰老是一個暫時的細胞狀態,而且具有可逆性,也為治療細胞衰老引起的疾病提供了一個新的思路。


小鼠胚胎期衰老細胞在胚胎髮育後期重新進入細胞周期並貢獻至出生後的組織

a. 小鼠E10.5-P0天前肢SAβ-Gal染色。箭頭指示SAβ-Gal陽性細胞,在E10.5-E14.5天頂端外胚層脊髓(AER)有陽性SAβ-Gal信號。

b. SAβ-Gal活性示意圖。證明SAβ-Gal染色檢測到的衰老細胞存在於E10.5-E14.5,而E15.5天後SAβ-Gal活性消失。

c. P21-CreER基因敲入工具鼠構建示意圖。 

d. P21-CreER小鼠胚胎整體P21和ESR免疫染色與胚胎肢體中的SAβ-Gal具有相似的表達模式(與圖a相比),表明衰老細胞的AER在中期表達高水平的P21(例如E10.5-E13.5)。 

e. P21-CreER小鼠四肢P21和CreER表達譜示意圖。 E10.5-E13.5胚胎前肢中的CreER表達主要在AER內,而E14.5天開始P21和CreER的表達下降,E15.5天後就消失了,與內源性P21表達基本一致。

f. P21-CreER小鼠四肢切片P21和ESR免疫染色結果。

g. 他莫昔芬誘導Cre-loxP重組譜系示蹤策略示意圖,他莫昔芬誘導後CreER入核發揮重組活性,使表達P21的細胞被標記上tdTomato熒光信號。 

h. 誘導譜系示蹤流程圖。 

i. P21-CreER;R26-tdTomato小鼠未經他莫昔芬誘導時胚胎整體/切片中沒有tdTomato的表達,表明沒有P21-CreER的泄漏。

j. E12.5-P0天P21-CreER;R26-tdTomato小鼠他莫昔芬誘導示蹤後,在胚胎髮育中期AER中很容易檢測到tdTomato陽性細胞。而在胚胎髮育晚期,仍有部分被tdTomato標記的P21陽性衰老細胞維持着上皮細胞的命運。

k. E15.5和E16.5天四肢切片中tdTomato、EdU、 E-cadherin (E-Cad)免疫染色。箭頭表示增殖的tdTomato陽性細胞(約有10%的tdTomato+EdU+細胞),表明它們重新進入細胞周期開始增殖。

l.  增殖的tdTomato陽性上皮細胞定量統計。tdTomato+和tdTomato-上皮細胞之間的EdU摻入沒有顯着差異。



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